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有无藻红蛋白的微囊藻株的
16srDNA
序列与系统发育分析
Shigeto Otsuka
，
Shoichiro Suda , Renhui Li
,
MasayukiWatanabe , Hiroshi Oyaizu ,
Satoshi
Matsumoto , Makoto M. Watanabe
摘
要
通过测定
16S
rDNA
序列（
16S rRNA
基因
）
，对含有五个变种和两种藻胆色素的
15
株微囊藻进行了系统发育分析。所有的序列显示出了较高的相似性，不同形态
与类型
的藻胆素之间，有些甚至
100%
的相似。从中可以推导出系统
进化树与有
无藻红蛋白的微囊藻株之间的密切关系。数据显示微囊藻的表型不一定反映其
发展史，因此需要重新构建当前物种级别间的分类。
关键字
:
蓝藻
；微囊藻
；
16S rDNA
；分类
1.
介绍
微囊藻
属是一种有毒且能形成水华的蓝藻。根据伯杰氏细菌鉴定手册（第九
版）
[ 1 ]
可知，微囊藻的特点是具有气泡，细胞形状呈球形，倾向于形成聚集
体
或群体，有不定形的粘液或者胶被，无藻红蛋白等等。大部分物种是满足这些
标准的，近年来
[2
]
在日本海域区分了六个物种：绿色微囊藻
(A.
Brown),
惠
氏微囊藻
(Komaèrek), 铜绿微囊藻
(Kuëtzing), M.挪氏微囊藻(Komaèrek),
鱼害微囊藻和水华微囊藻(Wittrock)
.Komaèrek并没有将鱼害微囊藻和水化微
囊藻区分开
[
3 ]
。
“形态”一词用于对微囊藻种类进行分类，它包括细胞
的大小，
菌落的形态，和胶被的特性。尽管形态分类的正确性总是受到质疑，但目前却<
/p>
没人能解答。
最近对四株以藻红蛋白为藻胆素的铜绿微囊藻进行了分离。虽然藻红蛋白的
占有率不
符合上面所提到的标准的
[1]
，但除却藻胆素的成分不同之外
，这些生
物有着相同的作为微囊藻的分类特征。据观察这些菌株的菌落形态与铜绿微囊<
/p>
藻所具有的形态是相同的。然而，这些菌株是否应该根据形态特征归类为铜绿
微囊藻或者根据藻胆素成分不同而被归类为新物种却还不能确定。
应用分子遗传学分析已成为蓝藻分类的一种重要方法。以
16S
rDNA
为基础的
系统进化分析法是在
细菌的分类中广泛使用的一种工具，该方法的优越性也已
被证实
[5]
。
Neilan [6]
等人用
这个方法来探讨微囊藻的种间关系。然而，在微
囊藻属中他们没有找到任何系统发育与形
态特征之间的相关性，而且有、无藻
红蛋白的菌株之间的亲缘关系也没有检查。
在本文中，我们探讨了微囊藻株的
16SrDNA
序列和微囊藻形态的系统发育分
析，然后讨论是否藻胆素成分和形态特征的不同会影响系统发育。
2.
材料与方法
2.1.
蓝藻文化
菌株的研究如下：微囊藻
4A3, 4B3, T1-4, <
/p>
和
T17-1;
绿色微囊藻
TAC17
和
TAC78;
铜绿微囊藻
TAC71,
TAC86,
和
TAC170;
挪氏微囊藻
TAC20 and
TAC65;
和
鱼害微囊藻
TAC48
和
TAC91.
在我们以前的研究中
四株微囊藻全部是被隔离的
[4]
并均含有藻红蛋白，而其他不
含有藻红蛋白的则来自日本筑波国立科学博物
馆的藻类收藏。该菌株的来源：中国（微囊
藻
4A3
和
4B3
）
，泰国（微囊藻
t1-4
和
t17-1
）和日本（其他菌株）
。这些菌
株中除了
4B3
和
T17-1
均是无菌的。将该菌
株培养在
MA[7]
培养基中，温度为
25
±
1
℃，周期是
12:12 L/D
，同时用光子
通量密度为
30 µmol mˉ¹
s
ˉ¹
的日光灯的进行照射。
2.2.
引物设计
以蓝藻的
16S rDNA
序列为基础
，重新设计了扩增和测序的引物，但不包括被
Neilan[8]
重新修复的引物
23SR.
两对扩增的引物，
msr-s1f
和
msr-s2r
序列，在
基因数据库中进行比对
[9]
的时候显示出高特异性。无菌株的扩增引物是
msr1f
和
23sr
，而非无菌株的扩增引物是两对
msr1f
和
msr-s2r
，和<
/p>
msrs1f
和
23sr
。所
有的引物都是由由日本粉米尔斯有限公司商业合成。
（神奈川，日本）
。
2.3.
聚合酶链反应扩增和测序
依据
p
alinska
等人提取的
DNA
聚合
酶链反应（
PCR
）的模板
[ 10
]
，从被提取
的
DNA
中扩增
16S
rDNA
序列
。
Pcr
进行的条件是，
50-
or
100-
µl
的反应混合物，
0.05µl 的耐热扩增
DNA
聚合酶
(Perkin Elmer, Branchburg,
NJ,USA)
，
Perkin
El
mer
提供的缓冲液，
0.2mM
的<
/p>
dNTPs
，
0.5
uM
的引物，
0.01 ^
0.05
µlˉ¹
的基
因组
DNA
溶液（
100
^ 500 ng
µlˉ¹）
，
1.
5mM
处理过的氯化镁。该反应在一个接
地的热循环仪（
Hybaid, Teddington,Middlesex,
UK
）中运行，
94
℃预变性
5
min
，
94
℃变性
40
s
，
50
℃退火
30s
，
72
℃延伸
1
分钟
s
，循环
30
次，最后
72
℃
延伸
3
分钟。使用
microspin1
S-400
HR
柱
(Pharmacia
Biotech,Uppsala,
Sweden)
纯化扩增产物，用已被荧光标记引物的热循环测序试剂盒进行循环测序。
(Amersham Life Science,
Buckinghamshire
,UK)
。该反应产物使用
4%
的试剂盒
在
dsq-1000l
DNA
测序仪（岛津，东京，日本）上测序
。
I
2.4
比对和系统发育分析
and phylogenetic
analy