微生物综合试验——产淀粉酶细菌菌株的筛选和培育
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产淀粉酶细菌菌株的筛选和选育
邢大鹏
（合肥工业大学生物与食品工
程学院
2008
级食品科学与工程专业
08-1
班）
摘要：从合肥工业大学
校园内的土壤中筛选到一株产淀粉酶的细菌菌株。形态及生
理生化特征
< br>测定结果
表明，
菌株与芽
孢杆菌
属
(
Bacillaceae
)
中的枯草
芽孢杆菌
(
BacillussubtilisCohn
)
种的特征基本一致。然后利用划线分离法和富集培养制备一
定量的枯草芽孢杆菌
，最后利用
DNS
法测定其产酶活力。
关键词：淀粉酶，产酶，细菌，枯草芽孢杆菌
Amylase production
screening and selection of bacteria
strains
Xing
Dapeng
Abstract:
From the Hefei University of Technology campus in
the A strain
of
soil
amylase
producing
bacteria
strains.
Morphological,
physiological
and
biochemical
characteristics of test showed that, strains and
Bacillus
(Bacillaceae) in Bacillus
subtilis (BacillussubtilisCohn) basically the
same kinds of characteristics. Then use
the train crossed separation and
enrichment
of
preparation
of
certain
bacillus
subtilis,
finally,
using
the
DNS
method for determining the enzyme production
vigor.
Key words:
amylase,
enzyme production, bacteria,Bacillus,stubtilis.
芽孢杆菌是人类发现最早的细菌之一。早在
< br>1835
年，
Ehrenberg
所描述的
“
Vibriosubtilis
< br>”即是现在大家熟悉的“枯草芽孢杆菌”，它是由
Cohn
于
1872
年
正式命名的，
现作为芽孢杆菌属
(
Bacillaceae<
/p>
)
的模式菌株
[1]
。
从生物学特性来讲，
枯草芽孢杆菌具有典型的芽孢杆菌特
征，其细胞呈直杆状，大小
(0.8-1.2)
μ
m
×
(1.5-4.0)
μ
m
，单个，革兰氏染色阳性，着色均匀，可产荚膜，运动
(
周生鞭毛
)
；
芽孢中生或近中生，小于或等于细胞宽，呈椭圆至圆柱状；菌落粗糙，不透明，扩
张，污白色或微带黄色；能液化明胶，胨化牛奶，还原硝酸盐，水解淀粉，为典型
< br>好氧菌
[2]
。
1997
年，
Kunst F.
等人首先完成了枯草芽孢杆菌的完整基因组序列测定，并将
结果发表在
《
Nature
》杂志上
[3]
。
工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组
成部分。
据来自
BBC
的统计数字，<
/p>
2004
年全球酶的交易额达到
20.0
亿美元
(15.3
亿欧元
)
，
其中食品酶占
29%<
/p>
，
饲料酶占
15%
，
一般的工业酶占
56%
。
枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，
据不
完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的
50%
< br>。由于其产酶量高、种类多、
安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用
作生产菌种，其发酵生产的酶
已在食品、
饲料、
洗涤、
纺织、
皮革、
造纸和医
药等领域均发挥着十分重要的作用。
枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分
丰富，这决定了其自身含有丰
富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明
，枯草芽孢杆菌能够产
生蛋白酶、
α
2
淀粉酶、纤维素酶、
β
2
葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十
几种酶
[
4]
。
枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、
淀
粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，
仅
二者就占到了整个工业酶
市场的
50%[5]
。其中，淀粉酶的生产和应用处于整个酶制
剂的首位，
其最早是在
20
世纪初，
由德国的
Boiden
< br>和
Effront
先后从枯草芽孢杆菌培
养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。
1
材料和方法
1.1
材料
1.1.1
菌种来源：
筛选的土壤
来自合肥工业大学主教学楼前的绿化带。
1.1.2
培养基：
淀粉培养基
:
可溶性淀粉
1%
、蛋白胨
1%
、
葡萄糖
0.
5%
、
NaCl 0.
5%
、牛肉膏
0.
5%
、琼脂粉
0. 8%
种子培养基
:
牛肉膏
0.
5%
蛋白胨
1%
、
NaCl
0.
5%
、可溶性淀粉
0.
5%,
pH
值
7.
0;
发酵培养基
:
玉米粉
2%
、黄豆饼粉
1.
5%
、
CaCl2
0.
02%
、
MgSO4
0.
02%
、
NaCl
0.
25%
、
K2HPO4
0.
2%
、柠檬酸钠
0.
2%
、硫酸氨
0.
075%
(
溶解后加
)
、
Na2HPO4 0. 2% ,
pH
值
7.
0
。
1.1.3
仪器：
分光光度计
,
购离心机，全温
摇床
.
1.2
菌种筛选
1.2.1
初筛：
< br>从主教前的小树林中池塘边采集土样，
称取
5g
土样，
无菌水溶
解初筛
:
附近采集土样
,
称取
5 g
土样
,
放入装有
45mL
无菌水的三角瓶中
,
放入装有
45mL
无菌水的三角瓶中
,
震荡
20m
in
后静置
5m
in
,
然后进行浓度梯度稀释到
10
,
分别在
1
0
-4
、
10
-5
、
10
-6
浓度下各取
1
mL
土壤稀释液制成混菌平板
,
培养皿放入
37
℃
培养箱中培养
24 h
.
取出培养好的平皿
,
在长出的菌落
上滴加碘液
,
菌落周围如有
无色透明圈
出现
,
说明淀粉被水解
,
即该菌株能产生淀粉
.
酶
.
-6
1.2.2
划线分离
从初筛所得的菌落中选择菌
落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线
分离。将划线分离后的培养皿放入
37
℃
培养箱中培养
24 h .
1.2.3
富集培养
从上一步中划线分离所得的培养基中挑选产酶活力较高的单个菌落，在斜面培养基
上进行富集培养。将斜面培养基放入
37
℃
培养箱中培养
24 h .
1.2.4
发酵培养
从斜面培养基上挑选生长状况良好的菌株转移到发酵培养基上，
在后
,
无菌操作加入
培养基中。发酵的条件为
37
℃
，
200 r /m in
，
24h
。
2
．
结果与分析
2.1.1
筛选结果及分析
:
在自然界的土壤中存在能产生淀粉酶的芽孢杆菌，通过土样稀释、加热土样悬
液、杀死非芽孢细菌、平板分离可获得疑似芽胞杆菌的单菌落，将单菌落点接含有
淀粉的平板，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，
在淀
粉平板上菌落周围也会出现水解圈，但肉眼不易分辨，用碘液染色法染色后显
现出透明圈
，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。由此可将产淀粉酶能力的菌株分
离。透明圈与菌落
直径比值的大小在一定程度上反映了
分析：
< br>菌株产生淀粉酶的能力：前者与后者的比值越大，表明分泌的淀粉酶
越多，水解淀
粉的能力也就越强。
数据：
H/C
1.20