真菌学实验报告
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真菌学实验报告
一
.
实验目的：
1.1
了解真菌形态的基本特征。
1.2
掌握丝状真菌制片方法。
1.3
掌握内生真菌的分离方法
1.4
掌握真菌的鉴定方法。
二
.
前言：
真菌广泛分布于地球表面
,
从高山、湖
泊到田野、森林，从
海洋、高空到赤道、两极，到处都有真菌。真菌虽然不在空气中生长
繁殖，
但它的孢子却成群的漂浮在天空，
只要稍微注意你会发现人类
原来生活在真菌的汪洋大海中。
当今世界，生物技术已迈入世界经济的支柱产业，真菌学
在生物
技术的大潮中得到了长足的发展。
真菌是原始的真核生物，
具<
/p>
有广泛的多样性，
真菌生长我繁殖迅速，
在很短的时间内就可以得到
比动物和植物多得多的后代，
能够直
接、
快速地进行遗传性状分离的
分析。因此，真菌可以作为研究
基础生物学过程中的一个重要工具，
真菌基因的多样性以及真菌分子生物学的发展，
为生物技术产业提供
了一个广阔的天地。
植物的生长环境直接影响内生真菌的生物多样性，植物物
种的年
代越久远，
其生物内生真菌的多样性越丰富：
抗病原性能越强<
/p>
的植物，
其所含的内生真菌具有抗菌活性的可能行就越大；
其所含的
内生真菌有可能产生与植物相同或相似的抗菌无知或产生抗菌
活性
物质可能参与了药用植物的抗菌过程，本实验通过植物病原真菌和
< br>G+
、
G-
细菌的抑制实验发现
茎，根，花，种子或果实内生真菌的代谢
产物具有不同程度的抑菌能力，并且对
G+
、
G-
有普片遍的
抑菌作用。
研究和开发内生真菌的寻找新的抗菌活性物质具有广泛的应用前景。
三
.
材料与方法：
3.1.1
材料：
< br>在校园内采集银杏、喜树、桂花树样品包括叶、茎、
根、花、种子或果实。
3.1.2.
药品与试剂：
葡萄糖、蛋白胨、
KH2P04
·
3H2O
、
MgSO4
·<
/p>
7H2O
，马铃
薯、琼脂。孟加拉红，青
霉素，链霉素，甲基蓝，蛋白胨，酵母膏，
蔗糖，磷酸盐，葡萄糖，琼脂条，无菌水等。
消毒剂：
75%
的乙醇，
0.1%
升汞（
HgCl
2
）
，次氯酸钠溶液（含活性氯
10%
）
，
30%
双氧水。双
< br>蒸水、琼脂糖，
Tris
饱和酚、巯基乙醇
(
β
- Mercaptoethanol)
，石
英砂，
Tris
饱和酚，氯仿，异戊醇，无水乙醇，硼酸，冰醋酸，氯
化钠，盐酸，氢氧化钠，
EDTA
，
CTAB
。
3.1.3.
培养基：
3.1.3.1
马铃薯、葡萄糖琼脂
培养基
马铃薯汁
1000ml
，葡萄糖
20g
，琼脂
20g
< br>（注：取去皮马铃薯
200
克，切成小块，加水
1000
毫升煮
沸
30
分钟，
滤去马铃薯块，将滤液补足至
1
000
毫升，加葡
萄糖
20
克，琼脂
15
克，溶化后分装，
< br>15
磅灭菌
30
分钟
3.1.3.2
察氏琼脂培养基
蔗糖
30g<
/p>
，
NaNO
3
3g
，
MgSO
4
.7H
2
O
0.5g
，
KCl
< br>0.5g
，
FeSO
4
.7H
2
O
0.01
g
，
K
2
HP
O
4
1g
，琼脂
13g
，蒸馏水
1000ml
，自
然
pH
3.1.3.3
沙氏培养基
蛋白胨
1g
，葡萄糖或麦芽糖
4
g
，琼脂
1.5
克，水
100
ml
。
制法
：
1
将上述物质称好，放入水中煮沸溶解（不必调
PH
即有
5
左右）分中号试
管（约
4
毫升）包扎，高压
115
℃
20
分钟。趁
热
斜好，凝固备用。
3.1.3.4
马丁氏培养基
葡萄糖
10g
，蛋白胨
5g
，
KH
2
PO
4
1g
，
MgSO
4
·
7H
2
O 0.5g
，
1%
孟加拉红
3.3mL
，琼脂
< br>20g
，
水
1000mL
，
< br>pH
值自然。
抗生素用法与用
量：培养基灭菌之后分装前按链霉素
40U/mL
，青霉素
30U/mL
用量加入，冷却到
45
℃左右未凝固时加入抗
生素，混匀倒平板。
四
.
方法：
4.1.1
采样方法：
在校园内找到银杏、喜树、桂花树并用刀采集叶、茎、
根、皮、种子。
4.1.2
样品前处理：
分别取根、
茎、
叶、
果实
，
用洗涤剂在自来水下洗净。
老树皮
用
75%
酒精进行表面消毒后，用镊子取出，于
酒精灯上烧灼
15
秒至表面焦糊，
切成
1×1cm
2
大小置于
PDA
固体培养
基上。
对于根、茎、叶、果实按下列程序进行表面消毒：
75%<
/p>
的酒精漂（浸）洗
2-
3min→无菌水
冲洗
4-6
次→
0.1%
升汞不同的
消毒时间（见表
2-2
< br>，共设置
7
个梯度）→无菌水冲洗
4-6
次→用灭
菌滤纸吸干多余水分→无菌刀片将材料切成小
块将根、
茎的表皮、
韧
皮部、木质部大
致分开，并切成
0.5×0.5cm
2
大小。
将果实的外种皮去掉，消毒之后将内种皮去掉。
灭菌时，
沥干的植物材料转放到烧杯中，
记好时间，
倒入消毒溶液，
不时用玻璃棒轻轻搅动，
以促进材料各部分与消毒溶
液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。在快到时间之前
1-2
分钟，开
始把消毒液倾入一备好的大
烧杯内，
要注意勿使材料倒出，
倾净后立
即倒入无菌水，轻搅漂洗。
灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无
< br>菌水时为止。灭菌液要充分浸没材料。宁可多用些灭菌液，切勿勉强
在一个体积偏
小的容器中使用很多材料灭菌。
4.1.3
内生菌的分离方法：
<
/p>
将上述组织块置于分离培养基上
（每一平皿培养
< br>5
块组织块）
于
27℃恒温培养
，
同时将上述消毒过程中最后一次冲洗
组织块后的无菌水滴在培
养基上平行培养，用以检测消毒是否彻底。
观察菌丝生长情况及污染情况。
4.1.4
纯化方法：
培养
3-4
天后及时采用尖端菌丝挑取法，
挑取形
态不同的菌丝或菌落移种到新鲜
PDA<
/p>
培养基上。
纯化
3-4
< br>次以保证所
得菌落为纯培养。
4.2
形态鉴定方法：
4.2.1
培养方法：
4.2.1.1
培养基：查氏培养基、沙氏培养基和
PDA
培养基。
4.2.1.2
将
4
℃保存菌种活化
2
次；
4.2.1.3
将活化菌种分别点种
PDA
、沙氏、察氏平板，每
重复
4.2.1.425
℃恒温培养
箱培养
7
天；
4.2.1.5
然后进行菌落特征描述，取一个平行进行制片（胶带
< br>子粘片法），观察个体形态；
4.2.1.6
另两个平行继续培养至
14
天，取出；
4.2.1.7
重复步骤
4
，作为最终描述结果；
4.2
.1.8
根据真菌分类鉴定手册和相关资料分析确该菌的归
属。
4.2.2
制片方法：
胶带粘贴法：
选用在显微镜油镜下观察细致不粗糙且粘性好的
胶带。取一小段胶带从菌落表面的中心向边缘粘，
75%
乙醇固定，乳
酸石炭酸棉蓝染色液染色，将粘有菌丝的一面向上，盖上盖玻片，于
显微镜下观察产孢结构等特征。
4.2.3
鉴定标准：
观察的要点：
4.2.4
菌落宏观形态：
大小：以菌落的直径（
mm
）表示。
颜色：包括菌落表面和背面的颜色，及色素是否渗入培养基。
菌落表面的纹饰：如皱纹、辐射沟纹、同心环、整个菌落致密或
疏松等。
菌落的质地：毡状、毯状、绒毛状、棉絮状、粉粒状
、革质状、
有无成束状或绳状的气生菌丝。
菌落的高度：扁平、凸起或隆起，及菌落中心部分状况等。
菌落边缘：全缘、锯齿状、树枝状等。
渗出物：菌落表面有无液滴及液滴的颜色等。
4.2.5
个体形态：
菌丝的特征：表面性状（粗糙或光滑）
，宽度等
<
/p>
分生孢子梗：分支情况
--
简单或复杂，
轮生或单生等；长短；基
部粗糙或光滑等。
< br>产孢结构的形态特征：形状，大小，着生状况（位置，单生、互
生或成轮生体）<
/p>
分生孢子的形态：形状，大小，表面状况，聚集方式（直链、斜
链或聚集成
头）
4.3
分子生物学鉴定：
4.3.1
培养方法：
培养基成分与不加琼脂的
PDA
固体培养基成分相同
。将液体
培养基以
100mL
每瓶分装
至
250mL
三角瓶中，
用
8
层纱布封口。
121
℃
，
蒸汽灭菌
20min
。
将菌丝致密的真菌接种到液体培养基中，于恒温振荡培养箱中
27
℃、
120rpm
培养
5-7
天。用两层灭菌纱布过滤菌丝球，用无菌蒸馏水冲洗菌丝
球
5
次，避免培养基中的糖类和蛋白对
DNA
提取的影响。
40
℃下烘干菌丝
，但是不
要过于干燥，然后进行
DNA
的提取。
4.3.2
基因组
DNA
的提取
DNA
提取采用
CTAB
< br>法。
CTAB
（
cetyltr
iethylammonium
bromide
，十六烷基三
乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，
它能与核酸形成复合物，
< br>在高盐溶液中是可溶的，
当降低溶液盐浓度
到一定程度时
，从溶液中沉淀，通过离心可将
CTAB
与核酸的复合物