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人类Ago2蛋白与肿瘤的关系研究

作者：林爱琴 赵跃华

来源：《安徽农业科学》2014年第11期

摘要 Argonaute2（Ago2）蛋白是RNA诱导沉默复合体（RNAinduced silencing complex、
RISC）的核心元件，不仅在miRNAsiRNA通路中促使靶mRNA降解或抑 制其蛋白质翻译，
调节miRNAs生物合成和成熟，对生物生长发育、干细胞分化和肿瘤形成等有密切 关系。
关键词 Argonaute2；RISC；翻译抑制；肿瘤
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）11-03169-03
Abstract Argonaute2（Ago2） protein， the core of RNAinduced silencing complex
（RISC）， complexed with the guide strand of a small interfering RNA（siRNA） or a microRNA
（miRNA） and ubiquitously expressed and binded to siRNAs or miRNAs to guide posttrascriptional
gene silencing either by destabilization of the mRNA or by translational repression. It has important
functions in processes as diverse as embryonic development， cell differentiation and tumor
biogenesis.
Key words Argonaute2； RISC； Translational repression； Tumor
Ago蛋白最初是从一种黑腹果蝇S2细胞中分离出来的，后来发现在生物体中广泛分布且
结构高度保守 ，它们都是分子量大约都在100 kD的碱性蛋白[1]，又名为GERP95（Golgi ER
Protein 95 ku）即与高尔基体和内质网膜相关的蛋白。多种生物基因组分析表明，不同种 群参
与Ago编码的基因数量从1～27不等[2]。哺乳动物有8个基因参与编码Ago，这个家族成 员
在结构上典型特征是Ago的N端含有130氨基酸的PAZ结构域、Mid结构域和在C末端含有< br>300个氨基酸组成的Piwi结构域[3]，这3个结构域对于Ago蛋白的功能发挥着重要作用。虽< br>然Ago家族成员都具有类似的结构，但研究表明只有Ago2才是RISC中功能组分[4]。笔者就< br>人类的Ago2结构与功能进行综述。现报道如下。
1 人类Ago2结构研究
2002年，Martinez等在siRNA 3′端标记 生物素，在人Hela细胞抽提物中得到了与siRNA
结合蛋白复合物，从中鉴定出了2个相对分子量 为100 kD蛋白，即Ago1和Ago2[1]。有8个
基因参与编码人类Ago蛋白，其中有4个 基因编码Ago亚族的Ago1、Ago3、Ago4和Ago2，
Ago1、Ago3、Ago4定位 于1号染色体（1p34～35）区带，Ago2定位在8号染色体；另4个基
因编码Piwi亚族的H IWI1、HIWI2、HIWI3 和HIWI4蛋白，依次定位于12、11、22和8号染
色体。 人类Ago2由4个区域组成，N端、PAZ结构域、Mid结构域和Piwi结构域。PAZ结构
域是 一个由6条链构成的左手β桶，在桶的一端连接有2个螺旋，另一端连接1个αβ组件，
在β桶与αβ组 件之间形成1个口袋状结构，恰好可以插入RNAs 5′末端突出的2个碱基，这就

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是siRNA的结合 位点。Mid结构域与小RNAs的5′端磷酸结构结合将小RNAs与Ago蛋白锚定
（或啮合）。M id结构域中还含有1个高度保守的motif结构，其与elf4E（eukaryotic
translational initiation factor 4E）的7甲基鸟嘌呤（m7G ）帽结构相似。正是这个类似m7G帽
结构阻止人Ago2与elf4E的结合，从而对靶mRNA的转 录起始起到阻遏作用。Piwi结构域是
1种属于RNase.Ⅲ家族结构域，均含有螺旋包围的5个片 层结构，Piwi与RNase.Ⅲ一样催化切
割siRNA与RNA形成的dsRNA中的单链RNA ，因而具有核酸内切酶的活性[1]，切割产物具
有3′OH和5′磷酸结构，Piwi结构域中的Pi wibox区（盒）可以直接与Dicer酶结合[2]。Liu等
[5]在293T细胞中证明Ago 14都能与siRNA结合，但只有Ago2具有“切割”活性，在小鼠中敲
除Ago2基因出现一些异 常的发育从而导致胚胎死亡。进一步研究发现人类Ago2“切割”（即核
酸内切酶）活性中心由Asp 597、Asp669、和His807 3个氨基酸组成，若Ago2的D669位点突
变，Ago2功能丧失[6]。
2 Ago2的装配研究
Ago2具有抑制蛋白质翻译和促进miRNA、piRN As生物合成和成熟的miRNA表达的功
能，Ago2是RISC的核心成分，与miRNA与siR NA结合构成RISC通过碱基互补原理与靶
miRNA完全或不完全互补结合产生效应的。Ago2的 装配过程也就是RISC的形成过程，可分
为起始阶段和效应阶段。
2.1 起始阶段 主要是内源性或外源性长链RNA（dsRNA）在Ago2介导下生物合成成熟的
miRN A、siRNA或piRNA的过程。首先DNA重复序列编码长链miRNA，由Diosha对细胞核
里miRNA前体进行剪切，核膜蛋白主动运输于细胞质中，再被Dicer酶剪切掉茎环部成为成
熟 的长约18～24核苷酸的双链miRNA。Dicer酶还能对外源性dsRNA分子加工成小的双链
siRNA[3]。
2.2 效应阶段 与以往观点不同最新研究认为，目前认为双 链RNA（dsRNA）在Ago2介导
下结合RISC并生成2条单链（即正义链和反义链）是不依赖 ATP的[7]，其中反义链与Ago2
的PAZ结构域结合，形成Ago2的核糖核蛋白（RNP）复 合体。siRNA与靶mRNA序列之间
是完全或接近完全互补的。Ago2介导对转录本剪切在距离单 链siRNA5′10nt的位点进行。
miRNA与靶mRNA 5′端UTR位点不完全互补产生翻 译抑制，其反应关键特征是：miRNA和
靶mRNA之间存在序列错配[4]。RISC在形成过程中 还需要其他蛋白的参与，如TRBP和
PACT。
2.3 Ago2装配过程几个关键问题的探讨 Ago2装配中的dsRNA“不对称”的选择：RISC
A go2是如何判定降解dsRNA正义链的？Khvorova等[8]分析了siRNA链两端的热动力学稳定
性，发现反义链5′端的热力学稳定性差，因而被保留进入RISC复合体成为向导链，有人将这
一现象称为“不对称原理（asymmetry rule）”。
Ago2在RN As沉默途径中的“脱靶”效应：在RNAs沉默途径中，Ago2因其没有序列特异
性，可与各种不同 序列小RNAs结合，形成RISC。为确保Ago2与小RNAs精确结合而不是降

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解这些效应分子，导致“脱靶”效应。这条沉默途径还需要1个特定的结构构成 监视系统，这种
监视系统可能是小RNAs的5′末端突出的2个碱基恰好插入Ago2的PAZ结构域 的口袋状结构
[2]。另外，小RNAs与RISC结合诱导靶mRNA降解，需要小RNAs的5′端 磷酸化结构与
Ago2的Mid结构域锚定[9]。
Ago2在装配中的筛选和修饰作用：人体内Dicer只发现1种，而人的miRNA已报道1
80 0多种（miRBase），外源性siRNA种类更多。尽管Dicer含有多种功能的结构域，但对众
多的siRNAmiRNA结合与切割是否存在筛选，未见报道。人类Ago亚族有4种蛋白即
hAg o1～4，目前只发现Ago2具有核酸内切酶活性，Dicer募集哪一种Ago组装RISC，其筛选
机制、有报道认为可能与靶mRNA碱基互补精确度及互补链末端结构相关[10]。
miRNA的5′端的2～7个碱基是miRNA识别的关键，siRNA的5′端的磷酸化是siRNA识别关键。Filipowicz[11]认为当miRNA的碱基配对核心区与靶mRNA形成完全互补双链 时，这
种双链可形成A型螺旋与Ago2的DDH氨基酸结构区结合，miRNA可以对转录体切割降解 ，
当不完全配对影响A型螺旋的形成时则表现出对转录体翻译抑制。Ago2具有的核酸内切酶活
性还可以对靶mRNA碱基错配或环状突起碱基异常结构进行切割修饰。
Ago2 在RNAs沉默途径中的抑制蛋白合成机制：Ago2在与miRNAs结合形成RISC后，
靶向mR NA进入胞质处理小体（pbodies），进而通过3种方式抑制蛋白质合成：①诱导
mRNA脱腺苷 酸化和脱帽，启动mRNA降解；②通过Ago2和翻译起始因子竞争与mRNA
M7G帽子的结合， 阻碍功能性核糖体的装配，造成翻译起始抑制；③通过募集多肽链降解
（翻译延伸）相关的细胞因子（肽 酶、翻译后修饰酶）使核糖体脱离肽链或新合成的肽链迅速
降解，这一过程发生在翻译起始后[12]。 免疫荧光定位证明，Ago2大多定位于细胞质中，并在
P小体中富集，参与上述的转录后水平的基因沉 默。但仍有一小部分Ago2定位于细胞核中，
它们作用于DNA启动子区域，使靶基因和组蛋白甲基化 ，从而抑制基因表达。最近发现Ago2
介导的miRNA在无血清细胞的AU富集区域，可以增强转录 本的翻译。有人估计，在人类基
因组中大于30%的基因的表达都受与Ago相关的RNAi现象的调控 [13]。探索Ago2在人类细
胞，尤其是肿瘤细胞相关性研究已成为肿瘤的基因诊断和治疗的新亮点 。
3 Ago2与肿瘤的关系
3.1 Ago2过表达与肿瘤的关系 Ago家族蛋白与多种肿瘤密切相关，hAgo1、hAgo3和
hAg o4基因前后排列在人1号染色体p34～35，在wilms肾癌中经常缺失，还与神经外胚层瘤
相关 [14]。hAgo1在肺和肾的发育过程中高表达，在缺少wilms肿瘤抑制基因WT1的肾癌中过
表达[15]。在对人类乳腺癌MCF7、宫颈癌Hela、肺腺癌A549和胚肾细胞HEK293这4种细< br>胞系中Ago1～4的转录图谱显示，其细胞系普遍存在稳定表达，其中Ago2和Ago3转录水平较高且相对稳定。Zhang等[16]研究227例卵巢癌、乳腺癌及黑素瘤标本的miRNA表达谱，同
时分析miRNA靶基因的DNA拷贝数，结果发现在3种肿瘤中Ago2的DNA拷贝数的变异率均明显增加。对乳腺癌的进一步研究显示：Ago2在侵袭性较高的乳腺癌、basellike、HER2 过
表达和luminal B型的表达增高，且在ER- 乳腺癌表达高于ER+乳腺癌患者，说明Ago2过表达