英文翻译
孙中山故居-
核磁共振法测量中间产物证明结核分枝杆菌
aurum MO1
的细
胞色素
P450
氧
化硫代吗啉和吗啉
Bruno
Combourieu
,
Pascal
Poupin
,
Pascale
Besse
,
Martine
Sancelme
,
Henri
Veschambre
1
,
Nicole Truffaut2 & Anne-Marie Delort1,*
1
Laboratoire
de
Synth`ese,
Electrosynth`ese
et
Etude
de
Syst`emes
`aInt´
erê
t
Biologique, UMR 6504 CNRS,
Universit´
e Blaise Pascal, 63177
Aubi`ere Cedex, France;
2Laboratoire de
G´
en´
etique Microbienne,
Universit´
e Technologique de
Compi`egne, B.P
.
649,
60206
Compi`egne,
France
(*author
for
correspondence,
e-mail:
amdelort@)
1
2
1
1
【关键词】
：细胞色素
P450
、核磁共振、结核分枝
杆菌、吗啉、硫代吗啉
【摘要】
：
通过分光光度法检测结核分歧杆菌
aurum MO1
在参与化工废物吗啉的降解过程中，
提
取了一种
可溶性的细胞色素
P450
。为了进一步了解它的信息，利用核
磁共振
(NMR)
来检测
硫代吗啉生物
降解动力学过程。
这项技术可以鉴定两种中间产物：
硫代吗啉产
生亚砜是由于
S-
氧化以及环裂解生成亚硫基二乙酸。
S-
氧化（
S
→
SO
）表示细胞色素
P450
的催化作用产
生一种反应。甲吡酮是细胞色素
P450
的抑制剂，它在硫代吗啉和吗啉的降解过程中对
M.
aurum MO1
菌的抑制作用证明含有细胞色素
P450
。上述研究结果以及吗啉降解初级代谢产
物
2
-
（
2-
氨基乙氧基）乙酸和乙醇酸形成速率的下降，证明了细胞色素
P450
在生物降解
过程中对
C-N
键断裂起关键作用。
【简介】
：
吗啉为氮杂环化合物，
含有仲胺基团，
主要用于橡胶助剂生产与应用（催化剂，
溶剂，
抗氧化剂等）<
/p>
（
Mjos1978
年
< br>;
Anon1989
年）
，它
的应用范围不断扩大，通过工业废水，进入
环境。根据报道，由于其对亚硝化作用产生有
力的诱变并产生致癌物质
N-
亚硝基吗啉（匿
< br>名
1989
年
; Enzman
n
等
1995
年）
，
所以它在废水甚至食品中的存在引起人们格外关注
（
Singer
和
Lijinski1976
年）
。
在文
献中，许多研究工作已报道吗啉的生物降解属于结核分枝杆菌株（
Cech
等
1988
；
1988
年
Dmitrenko
与
< br>Gvozdyak
；
Knapp
等
1982
年；
Knapp
和
Brown
1988
年
；
Mazure
和
Truffaut
1994
年
; Poupin
等，
1998
年）
，节杆菌（
< br>Dmitrenko
等人，
1987
年）或革兰氏阴性菌
（
Knapp 1996
年）等。生物降解途径没有确定，因为没有直接检测中间产物的方法。然而，
在最近的研究中（
Combourieu
等，
< br>1998
）
，通过使用原位核磁共振光谱测定结核分枝杆
菌
aurum MO1
降解过程的两种代谢产物，使中间产物可
以被定性和定量。降解过程的中间产
物为
2 -
（
2 -
氨基乙氧基）乙酸和乙醇酸
，这与
Swain
所鉴定的分歧杆菌降解过程的中间
产物一致
(Swain
等
.
1991)
。
为了了解结核分歧杆菌
aurum MO1
生物降解途径的机理，
我们将进一步研究酶参与的
类型。<
/p>
Knapp
（
Knapp
等人，
1982
年）和
Mazure
（
Mazure
和
Truffaut 1994
年）表明，吗啉降<
/p>
解与耗氧量有关，
说明可能有单氧酶参与。
单氧酶是广泛分布的酶，
它使氧分子活化，
一个
氧原子进入底物，另外一个被还原成水。大量的单氧酶含有一种血红蛋白称为细胞色素
P450
。
这些细胞色素
P4
50
参与各种阶段的内源性化合物的合成
（类固醇，
脂肪酸）
（
Waterman
等，
1986; Jefcoate1986
年）
，氧化解毒和消除许多疏水性外来物质（污染物，药品，农药
...
）
（
Wislocki
等人，
1980
年，
Guenge
rich1990
年
a
）
。因为它们广泛分布在生物体中，且在生
物化学，
药
理学和毒理学有重要的作用，
所以现在细胞色素
P450
已被广泛研究
（
Guengerich
1990
年
b; Ortiz de
Montellano 1986
年；
Ruckpaul &
Rein 1984
年
, 1990
年
）
。
几种细菌
（从链
< br>霉菌，假单胞菌，巨大芽孢杆菌）的细胞色素
P450
的
晶质结构被人们熟知，它们用来作为
人类细胞色素
P450
的模型（
Fulco1991
年，
1991
年
Asperger & Klebe
r
）
。其他几个菌属也含
有细胞色素<
/p>
P450
，
例如红球菌属，
它非常接近结核分枝杆菌
（
Asperger
等人，
1990
年；
Karlson
等
1993
年；
Nagy
等
1995
年）
。
最近，
我们由一株结核分枝杆菌
strain
菌株证明细胞色素
P45
0
参与吗啉降解的过程（
Poupin
和
Truffaut
，
1996
年；
Poupin
等
1998
）
。这促使我们进一步研
究结
核分枝杆菌
aurum
MO1
的细胞
色素
P450
在外源性物质生物降解过程中可能发挥的作
用。
在这项研究中，
我们通过传统光谱光度检测法证明，
分歧杆菌
aurum M
O1
中的可溶性
细胞色素
P450
存在于吗啉和硫代吗啉中。为了证明这种细菌在外源性物质降解途径中起的
< br>关键作用，我们通过核磁共振检测硫代吗啉的生物降解过程。结核分歧杆菌
aur
um
MO1
在
硫代吗啉上不生长（<
/p>
Mazure
与
Truffaut
，
1994
）
，但能
够使其降解。因此，预计代谢产物积
累的时间，
可以让我们更好
地了解杂环物质生物降解途径。
此外，
硫代吗啉的硫原子可以很
容易地氧化。
直接在水溶液中使用核磁共振技术，
可以对中间产物进行定性和定量分析，
表
明其可能参
与硫代吗啉的降解过程。加入细胞色素
P450
酶抑制剂（即甲
吡酮）到含有硫代
吗啉或吗啉的培养基中，发现它对结核分歧杆菌
aurum
MO1
的降解性能有抑制作用，从而
证明这种酶在两种化合物的生物转化中发挥的另一种关键作用。
【材料和方法】
：
< br>化学品：
硫代吗啉，
吗啉，
甲吡
酮，
间氯过氧苯甲酸
（购于
Sigma
Aldrich
公司，
St. Quentin
Fallavier,
法国）
，
TSPd4
（购于
EurisoTop
，
St.
Aubin
，法国）
。
生长条件：
结核分歧杆菌
aurum
MO1
在
500
毫升锥形瓶
（加入
100
毫升的大豆胰酶肉
< br>汤）
，
30
℃
< br>，
200 rpm
转速下培养
4
8
小时（
l'Etoile
，法国生物
梅里埃，马西）
。结核分歧杆菌
aurum MO1
培养在无机盐中（
Knapp
缓冲液：
1L
去离子水
,KH2PO4 1 g,
K2HPO4 1 g,
FeCl3.6H2O 4 mg
和
MgSO4.7H2O 40 mg, pH 6.6
）
,
滴加
10mM<
/p>
吗啉或
20 mM
醋酸，
进行分
光光度测量。进行硫代吗啉实验时，细胞生长在富集培养基中，离心收集
（
8000rpm
，
10
分
钟）
，用无机盐介质洗一次。然后在含有
5 mM
的硫代吗啉介质的液体培养基中摇床振荡培
养
6
小时（
30
< br>℃，
200
rpm
）
。
外源性物质培养：
收集细胞，在
5
℃，
9000rpm
下离心
15
分钟。去除上清液，用纳普
缓冲液洗两次沉淀物，最后细胞悬浮在这个缓冲
液中（
5
克湿细胞
50
毫升缓冲液）
。将细胞
培养在
500
毫升锥形瓶中，在
30
℃下，搅
拌（
200rpm
）
，
10mM
硫代吗啉或吗啉作为唯一能
源。加入抑制剂甲
吡酮（
5
或
10mM
< br>）进行试验。在相同条件下，在细胞培养中不加入抑制
剂作为对照，同样不加入细
胞做相同培养作为对照。样本（
1
毫升）每隔
< br>12
小时取一次样，
共测到
72
小时。在
12000
转
/
分钟条件下，离心
5
分钟，
取上清液，并立即冷藏，直到核磁
共振分析。
细胞色素
P450
的分光光度分析：
< br>在
4
℃下离心（
8000rpm
，
10
分钟）
，洗涤，分枝杆
菌细胞悬浮在含有
0.3mM
< br>苯甲基磺酰氟的磷酸盐缓冲液（
50 mM
）中（
pH
值
7.4
）
。通过细
胞破碎仪（
SLM-
Aminco
）
，在
18,000 p
si
下对细胞加压，并在
30000
转
/
分钟（
4
℃
）下离心
30
分钟，细菌的细胞壁被打破。在获得的上清液加入
亚硫酸氢钠，将上清液均匀的分到两
个比色皿中，在
CO
存在时，得出不同的吸光度
(Peterson
和
Lu 1991
年
).
。
91mM
.cm
的
消光系数是用来确定（大村和佐藤，
1964
年
）粗提取物中细胞色素
P450
的含量。所有的光
度分析测定用岛津
UV160A
分光光度计，用
Bradford
法测定蛋白浓度（
Bra
dford 1976
年）
。
核磁共振光谱：
制备核磁共振样本：上清液（
540μL
）在
D
2
< br>O
溶液
60μL
中添加
8mM
的
TSPd4
，
用
4N
的
NaOH
溶液调
pH
至
10
。调整
pH
值时应避免化学位移的变化。重水作
为锁场和匀场。
TSPd4
做化学位移（
0ppm
）和定量的参比。
1H
NMR
谱
:
在
21
℃下，
用
A
V
ANCE300 DSX
光谱仪
，在
300.13
兆赫下进行核磁共振
光谱或在
400.13
兆赫下用
400
AC
布鲁克的光谱仪，
用含
500μL
样品的直径为
5
毫米的管子；
通过传统
NOE
核磁共振仪程序水被饱和度所抑
制。
64
扫描收集。
采用傅里叶变换之
前没有
使用过滤器，在光谱实验基线校正前先进行布鲁克软件集成。在这些条件下，检出
限为
0.05mM
。
代谢产物的定量：
代谢产物的浓度，计算公式如下：
[M] =
（
9 Ao×
[TSPd4]
）
/
（
B×
Aref
）
[M]
是的代谢物的浓度；
Ao
是代谢产物；
M
核
磁共振谱共振区范围；
[TSPd4]
是浓度的参考；
Aref
是参考在
1H
NMR
谱的共振区；
B
是代谢产物
M
在信号集
成的
质子数；
9
是在
0
ppm
的共振质子数。
-1
-1
图
1
：
不同细胞提取物的
CO
光谱。结核分歧杆菌
aurum MO1
在吗啉中培养（谱
A
）
，
在醋酸中培养（谱
B
）
，以及在硫代吗啉中培养（谱
C
）
< br>，蛋白质含量分别为
10
，
10
，
11.5
毫克
/
毫升。
合成亚砜的硫代吗啉（<
/p>
Madesclaire1986
年）
：
二氯甲烷溶液（
50
毫升）中含有硫代吗
啉（
500
毫克，
4.85
毫摩尔）
，在
-15
℃
冷却，搅拌后，在二氯甲烷溶液中（
25
毫升）逐滴滴
加间氯过氧苯甲酸（
1.05 eq., 1 g
）
。另外搅拌溶液
3
小时，直到溶剂
被分离，通过闪光柱层
析法原油残渣被纯化（洗脱液：甲醇
/<
/p>
乙酸乙酯
93/7
）
，获得
70
％的亚砜。红外：宽带
1070-1130cm
-1
：
MS<
/p>
（
EI
）
，
119
（
M+
）<
/p>
，
102
，
71
，
56
。核磁共振光谱：分配不同的信
号是用
一维和二维
（
COSY
谱
1H-1H
和
1H-
13C
）
的实验。
根据加列戈等人给予
的
13C
化学位移
（
< br>1993
年）一个相关的杂环
1H-13C
分配质子（
HC-
HD
）和（
HA-HB
）分别连接到<
/p>
C-2
和
C-3
。
核磁共振
(400.13
MHz; CD3OD) 8:
2.69 ppm
(ddd, 2H, HB or HA);
2.87
ppm (ddd, 2H, HC or HD );
2.96 ppm (ddd, 2H, HA
or HB
);
3.39 ppm (ddd, 2H, HD
或
HC).
耦合常数
: JAC = 13.9 Hz, JAD
=2.4 Hz, JBC =3.1 Hz; JBD = 2.9 Hz.
13C
核磁共振
(100.61 MHz; CD3OD): 39.2 ppm (C-2);
47.8 ppm (C-3).
鉴定的代谢产物
X
：
与硫代吗啉培养
24
小时后，
上清液只包含代谢产物的
X
，
经过冷
冻干燥可以进行质谱分析（电子冲击）
< br>。质谱（
EI
）
：
150
（
M +
）
，
132
，
104
，
77
，
60
。
【结果】
：
【光谱光度法测量诱导细胞色素
P450
】
：
在以前的研究中（
1996<
/p>
年
Poupin
与
Truffaut Poupin
等
1998
年）
，我们证明了吗啉，
特别是
< br>strain
RP1
菌在降解分枝杆菌时有一种可溶性
的细胞色素
P450
参与。为了证实结核
分歧杆菌
aurum
MO1
中存在
单氧酶，我们测得的一氧化碳光谱差，表明亚硫酸氢钠降低吗
啉诱导细胞和非诱导细胞的
可溶性部分。
（图
1
）
：当结核分歧杆菌
aur
um
MO
在吗啉中培养时，吗啉作为唯一的碳源、氮源和
能量，其峰值在频谱（图
1
，谱
A
）上
449 nm
处，
表明存在一种可溶性的细胞色素
P450
。
由于细胞在醋酸下生长，没有观察到此峰（图
1
，谱
B
）
，则表明吗啉诱导合成这种酶。使
用硫代吗啉作为底物时（图
1
，频谱
C
）
，获得了类似的结果。细胞色素
P450
每毫克吗啉细
胞提取物含蛋白质约
70
pmol
，每毫克硫代吗啉细胞提取物
蛋白质约
60
pmol
。其他像吡咯
烷和哌啶胺结构相关的物质，也可诱导合成可溶性的细胞色素
P
450
（数据未显示）
。我们可
以合理
地得出结论，这些环胺可以诱导血红素单氧酶的合成。
【结核分歧杆菌
aurum
MO1
降解硫代吗啉】
：
通过核磁共振频谱研究分析了结核分歧杆菌
aurum
MO1
的上清液的休眠细胞（
5
克湿
细胞，纳普缓冲液
50
毫升）
（详细见上文的材料和方法部分）
，将其核磁共振光谱与
对照频
谱进行了比较。图
2
光谱收集是
0
，
8
，
12
和
22.5
H
。
在频谱的零时间，可看见三个主要的信号：在
0 ppm
的单峰属于
TSPd4
的甲基基团，
另外两个峰为
2.66
和
3.08
ppm
分别对应
CH2<
/p>
（
A
）和
CH2
（
B
）的硫代吗啉（图
8
）
。在
8
< br>小时时，硫代吗啉完全被耗尽，然后发现新的信号，特别是
2.86
，
2.99
，
3.10
和
3.39
PPM
这组四个信号共鸣，这似乎属于同一分子
(S)
，对新
(S)
信号进行检测表明它们先增加，然后
减
少。在
22H30
，中间产物（
S
）已经消失了。在
8
小时时，一个新的信号
（
X
）
在
3.
25 ppm
处单共振，其浓度随时间增加。
光谱光度实验先前已证实存在一种可溶性的细胞色素
P450
< br>，
然后做氧化硫代吗啉的硫
原子的实验（
Oldham
1989
年）
。
（
S
）的四个信号的表明它们耦合。
此外，它们的对称性表
明相应质子属于一环。因此，中间化合物（
S
）可能是亚砜。为了证实这一假说，进行式
1