什么是荧光定量(转)
泰戈尔的代表作-
.
1
、什么是定量
P
CR
？
以参照物为标准，
对
PCR
终产物进行分析或对
PCR
过程进行监测，
从而达到评估
样本中靶基因的拷贝数，称为定量
PCR
。定量
PCR
的可行性定量一般是在
PCR
扩
增的指数期进行的。
2
、定量
P
CR
定量的理论依据是什么？
特定的
待扩增基因片段起始含量越大，
则指数扩增过程越短，
当扩增速
率趋于稳
定后，
则无论原来样品中起始模板含量多少，
最终扩增片段的含量通常是一样的。
理想的扩
增结果：
Y=X
×
2n
其中
Y
代表扩增产物量，
X
代表
PCR
反应体中的原
始模板数
n
为扩增次数；理论上
PCR
扩增效率为
100%
，
PCR
产物随着循环的进
行成指数增长
，但实际上：
DNA
的每一次复制都不完全，即每一次扩增中，
模板
不是呈
2
的倍增长；实际应为：<
/p>
Y= X(1+E)n
，其中
E
代表扩增效率：
E =
参与
复制的模板
/
总模板，通常
E
≤
1
，
E
在整个
PCR
扩增过程中不是固定不
变的。通
常
X
在
1
～
10
5
拷贝、
循环次数
n
< br>≤
30
时，
E
相对稳定，
原始模板以相对固定的
指数形式增加，
适合定量分析，
这也就是所谓的指数期；
随
着循环次数
n
的增加
（
>30
次），
E
值逐渐减少，
Y
呈非固定的指数形式增加，最后进入平台期。
3
、荧光
定量
PCR
定量的理论模式又是什么？
PCR
是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，
任何干扰
PCR
指数扩增的因素都会
< br>影响扩增产物的量，
使得
PCR
扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固
定的比例关系，
通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。
近年来研究
人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量
PCR
方法，即
荧光定量
PCR
。
PCR
扩增通式：
①
Tn=T0
（
1+E
）
n
②
Tn=Tn-1
（
1+E
）
n
注：
[0
其中
E
表示扩增效率，
n
为循环数，
Tn
表示在
n
个周
期后
PCR
产物的数量，
Tn-1
表示在
n-1
个周期后
PCR
产物的数量，
T0
为原始模
板数量。设定
PCR
到达指数
扩增期时
，产生一定的荧光
(
荧光依赖于某一循环扩增产物的总量，即特
定的拷
贝数
K
，
为常数，
大约在
1010
左右
)
高于背景为仪器所识别，
此时的循环数为<
/p>
CP
（
crossing point<
/p>
）
,
也就是
K=
T0
（
1+E
）
CP
，取对数即：
lg K=lg
T0+CP*lg(1+E)
CP=- 1/lg(1+E)*lg T0
+lgk/lg(1+E)
.
.
由于对一特定的
PCR
而言，
E
与
K
均为常数，故上式为循环数（
CP
）对原始模板
拷贝数的对数（
lg T0
）一次方程，其标准形式
y=kx+b,<
/p>
该直线的斜率为
-
1/lg(1+E)
，在横坐标上的截距为
lgk/lg(1+E)
，也是荧光定量
PCR
所谓的标准
曲线。例如下图为单管实时荧光定量
RT-
PCR
的标准曲线：
目前荧光定量
PCR
均采用外标定量
外标法定量
PCR
扩增效率的计算，由于标准曲线的斜率
(Slope)<
/p>
为
- 1/lg(1+E)
，
可知
E=10-1/Slope-1 ,
如从标准
曲线中知道
Slope=-3.337,
则可推知扩增效率
E=101/3
。
337-1=0.99,
也有作者将
(1+E)
直接视为扩增效
率
E
，
则
E=
10-1/Slope
，
求得的
E
值均在
1
—
2
之间，有时也有大于
2
的结果，如下图所示
。另外也可直
接根据系列稀释外标在该次实时荧光
PCR
的结果来大略分析扩增效率的高低，
例
如系列
10
倍稀释外标在
PCR
扩增时有
N2=N0En2,
N3=(10*N0
)En3,
在扩增到指数
期时荧光值相同则代表此点的终末拷贝
数相同，即
N2=N3
，
En2-n3
=10,
取对数得
到⊿
ngE=1,
E=101/
⊿
n
，
< br>E=2
，⊿
n=3.32; E=1.8
，⊿
n=3.91.
反之亦然。
根据
PCR
扩增过程中是否加入某种标记物、
标记物的种类以及最后
检测的信号的
不同可分为四种类型：①直接定量检测法，
②同位素标记定量，③酶标记定量
检测法，④荧光定量
PCR
技术
荧光定量
PCR
< br>主要原理发射波长与受体荧光染料光染料吸收供体荧光传递的能
量而激发出另一波
长的荧光，同时将供体荧光淬灭。
SYBR Green I
检测模式
SYBR
Green
I
是一种能与双链
DNA
结合发光的荧光大增强。因此，
SYBR
Green
I
的检测出
PCR
体系存在的双链
DNA
数量。
SYBR Green I
的最大吸收波长约为
497nm
，发射波长最大约为
520nm
。
PCR
扩增程序一般为
94
℃～
55
℃～
72
℃三步
法，
40<
/p>
个循环。
SYBR Green I
的缺点：由于
SYBR Green I
没有特异性，不能识别特定的双链，
只要是双链就会结合发光，
对
PCR
反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生
荧光，通常本所以在临床上使用可能会有假阳性发生。
SYBR
Green I
的优点：
SYBR Green I
的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链
DNA
相结合，所
以对不同模板不需特别定制不同的这对科研是很有利的，
因此国内外在科研中使
用比较普遍。
5
、为什
么要用荧光定量
PCR
技术进行定量？它与传统的定量
PCR
有什么不同？
.
.
如前所述的，传统的定量
PCR
有很多，主要是倍比稀释法、内参照法、竞争法、
PCR-ELISA
法，但这些定量
PCR
技术的难点主要在于：（
1
）如何确定
PCR
正处
于线性扩增范围内（只有在此范围
内
PCR
产物信号才与初始模板的拷贝数成比
< br>例）。（
2
）一旦线性扩增范围确定以后，如何找到一个
合适的方法检测结果。
为了保证线性，研究者要扩增一系列梯度稀释的
< br>cDNA
或者对每个基因的扩增循
环数作适当的调整；<
/p>
有的研究者加一个竞争性模板，
有的做限制性的稀释梯度分
析，或者加一个
PCR
模拟（
mimic
）反应，即用相似的引物与目标产物共扩增，
而扩增产物的检测通常在跑胶以后通过染料、
放射活性或者探针进行检测。
（
3
）
大多数是终点检测
，
即
PCR
到达平台期后进行检测，<
/p>
而
PCR
经过对数期扩增到达
平台期时，
检测重现性极差。
同一个模板在
96
孔
PCR
仪上做
96
次重复实验，
所
< br>得结果有很大差异
（如下图所示）
，
因此无法直接从终点产物量推算出起始模板
量；虽然加入内标后，可部分消除终产物
定量所造成的不准确性。但即使如此，
传统的定量方法也都只能算作半定量、
粗略定量的方法，
所以传统定量
PCR
的缺
点是：劳动强度大、定量不准确、重复性差。
而荧光定量
PCR
有如下显著的优点：
1
、特异性好，使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性。同时，
靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。
2
< br>、灵敏度高，荧光
PCR
检测技术是综合了
PCR
技术、
荧光标记技术、
激光技术、
数码显象技术为一体的
技术，因此它的检测灵敏度
很高。
3
、线性关系好、线性范围宽，由于荧光信号
的产生和每次扩增产物成一一对应的关系，
通过荧光信号的检测可以直接对
产物
进行定量；定量范围可在
0
－
1010
拷贝
/
毫
升。
4
、操作简单、安全、自动化程度
高、防污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易污染；同时扩
增和检测
一步完成，不需要后期处理，不再需要担心放射性污染。
5
、速
度快、
高通量，可在
2
－
3
小时完成
96
个样品的定
量分析。
6
、荧光定量
PCR
为什么使用外标
定量，而不是内标定量？
A
、
内标对实时荧光定量
PCR
的影响若在待测样
品中加入已知起始拷贝数的内标，
则
PCR
反应变为双重
PCR
，双重
PCR
反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤
其当两种模板的起始
拷贝数相差比较大时，
这种竞争会表现得更为显著。
但由于
待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。
也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
B
、荧光定量
PCR
无需内标定量实时荧光定量
PCR
技术有效地解决了
传统定量只
能终点检测的局限，
实现了每一轮循环均检测一次荧
光信号的强度，
并记录在电
脑软件之中，通过对每个样品
Ct
值的计算，根据标准曲线获得定量结果。实时
荧光定量
PCR
无需内标是建立在两个基础之上的：
.
.
（
1
）
Ct
值的高度重
现性
PCR
循环在到达
Ct
值所在的循环数时，刚刚进入真正
的指数扩增期（对数期），此时微小误
差尚未放大，因此
Ct
值的重现性极好，
即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的
Ct
值是恒定的。
（
2
）
Ct
值与起始模板的线性关系由于
< br>Ct
值与起始模板的对数存在线性关系，
可利用标准曲线
对未知样品进行定量测定，
因此，
实时荧光定量
PCR
是一种采用
外标准曲线定量的方法。
美国
Texas
大学的科研人员进行了外标法定量
和内标法
定量的方法学比较，
得出的结论是：
< br>内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，
而外标准曲线的定量方法是一种准确
的、值得信赖的科学方法。
7
、为什么要用定量
PCR
而不是定性
PCR
？
在实验生物学及临床医学的一些场合，
由单纯
PCR
所提供的阳性或阴性结果还远
远不够，在阐述许多问题的
本质时，基因及其表达的定量起着至关重要的作用。
定量
PCR
常用来研究发病机制、
估计病毒的负荷量、
监测临床治疗进展或用于诊
断遗传缺陷等。
通过对靶基因量
的检测，
将其与疾病的临床表现、
临床分型以及
各种标志酶的值联系起来，
为疾病的诊断和药物疗效监测提供科学的依据。
与非
定量
PCR
分
析方法不同，
定量
PCR
分析的操作程
序有助于评估污染的情况，
即测
出污染的程度，
即使负对照产生了正的信号，
只要这些信号比实验样品的低得多，
依据这样的结果，
至少可以推测出实验中所得出的信号是真实的。
在一定程度上
消除了单纯
PCR
< br>过于敏感、假阳性率高的缺点。
8
、如何设计荧光定量
PCR
实验方案？
1)<
/p>
、大量阅读相关的背景资料后，根据自己所要研究的基因名称，在
genebank
中找到相应的基因序列。（
< br>）
2)
、用引物设计软件
Pr
imer5.0
、
Oligo6.0
或
beacon
designs3.0
进行引物探针的设计；（该软件可
在
下
载）
引物设计通常遵守如下原则：
A
、引物与模板的序列要紧密互补。
B
、引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。
C
、引物不能在模板的非目的位点引发
DNA
聚合反应
(
即错配
)
。
D
、引物长度通常在
20
－
25bp,Tm
值在
55
－
65
℃，
GC
含量在
40%
－
60%
，产物大
小在
100-250bp
之间。
.
.
E
、
引物的
3
’
端避免使用碱基
A
；<
/p>
引物
3
’
端避免
出现
3
个以上连续相同的碱基。
<
/p>
F
、为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子。
探针设计通常遵守如下原则：
A
、探针位置尽可能地靠近上游引物。
B
、探针长度通常在
20
－
30bp
，
Tm
值在
65
－
70
℃，通常比引物高
5
－
10
℃，
GC
含量在
40%
－
70%
。
C
、探针的
5
’端应避免使用碱基
G
。
D
、整条探针中，碱基
C
的含量要明显高于
G
的含量。
< br>
3
）、为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在
blast
中核实一次，如
果发现有非特异性互补区，
建议重新设计引
物探针。
(/blast)
4
）
、
根据仪器特点和个人的喜好，
选择标记的
荧光素种类。
如：
FAM
、
Texas
red
、
LC-
Red640
，
LC-Red705
等
，
同时确定荧光定量
PCR
的方法，<
/p>
选择
Taqman
或
beacon
等，可参考前面所述。
5
）、选择高品质的引物探针合成商，如闪晶生物等。
<
/p>
6
）、外标准品的制备：一种是化学合成目的基因，它的优点是纯
度高、定量准
确，缺点是受化学合成工艺的限制，只能合成
12
0bp
以下的长度；一种是将
PCR
扩
增产物直接梯度稀释，它的优点是方便、简单，缺点是不准确、不稳定；另一
种是将
PCR
产物克隆到载体上，
然后抽提出质粒
，
经过测量浓度和拷贝数的换算，
可准确定量，它的优点是稳定
、准确。如果是转基因食品，则要求转基因食品与
非转基因食品按一定的比例混合做成标
准品。稀释液可以是
TE
或者是闪晶生物
提供的
DNA
保存液。拷贝数＝（质量÷分子量）×
6.0
×
1023
。通
常外标由
4
个
点到
5
个点组成，
模板的浓度分别为
1
07/ml
、
106/ml
、
105/ml
、
104/ml
< br>、
103/ml
。
7
）
、
合成好的引物探针
，
最好用双蒸水稀释成
25pmol/ul
的浓度，
然后放－
20
℃
保存，
还应该注意避光保存探针。
如果是配成<
/p>
25pmol/ul
的浓度，
那么所加水
的
量是（
ul
）：
(OD
数×
33)
÷分子量×<
/p>
40000
8)
、
PCR
反应液的配制
1
×
PCR
buffer
、
0.3-0.5pmol/ul
的引物、
0.1
－
0.3pmol/ul
的探针、
2.5-4.0mM
的
Mg2+
、
1-2U
的
Taq
酶、
0.2
－
0.4mM
的
dNTPs
< br>、
0.2-1U
的
UNG
酶、
0.3-0.6mMdUTP
、
通常取
2-5ul
的模板、
反应总体积通常为
20
－
50ul
（以
上所有的浓度都是指终浓度）
.