软琼脂克隆形成实验步骤(完整版)
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Soft Agar Assay for Colony
Formation
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软琼脂克隆形成实验步骤
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注意：
软琼脂克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长
的细胞。适宜底物为玻璃的、塑
料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有
细胞团，接种密度不能过大。软琼脂培养法常用检测肿瘤细
胞和转化细胞系。接种细胞
的密度每平方厘米不超过
35
个，
正常细胞在悬浮状态下不能增殖，
不适用
于软琼脂克隆
形成试验。
1
、
配制
100ml
的<
/p>
1.2%
Argrose
和
0.7%Argrose
，
Argrose
用
DNA
电泳用
BI
OWEST
REGULAR
Argrose
G10
（
4
℃）
，溶剂用双蒸水（
DDW
）
，高压灭菌后，维持在
42
℃
中不会
凝固；配制
500ml
的
2
×
1640
和
0.005
%
的结晶紫。
2
、
实验前，将水浴锅放入超净台内，紫外照射，设定温度
4
2
℃。提前融化血清和双抗。
3
、
如已制好上下胶，则在微波炉中溶解
1.
2%Argrose
下胶和
0.7% Argrose
上胶，降温后
放入
42
℃水浴锅中保持。
4
、根据实验需要
的量配制
20%FBS+2
×
1640
+2
×
PS
（
5
种细胞配
40ml
）
，每种细胞设
3
个复孔。
<
/p>
5
、铺下胶：
按
1:1
比例使
1.2%Argrose
下胶和
20%FBS+2
×
1640+
2
×
PS
混合，
6
孔盘每
孔迅速加入
1.5ml
混合液，轻轻混匀，室温静置待下胶凝固（加混合液时不能产生气
泡
）
。
对于一个
6
孔盘，
配
5ml
上述培养液
+5ml 1.2%Argrose
下胶于
50
ml
离心管中
（离
心管要一直置于水浴
锅中）
。
6
、
细胞计数：
取对数生长期细胞，
用<
/p>
0.25%
胰蛋白酶消化并轻轻吹打，
使
之成为单细胞，
作活细胞计数，
用正常培养液调整细胞密度至<
/p>
40
×
10
4<
/p>
／
ml
以上，
这
样加的体积小于
100ul
，不会影响其他成分的稀释程度。每
孔铺
1
万个细胞，准备
4
个孔的细胞数，
即
4
×
10
4
。
7
、铺上胶：
按
1:
1
比例混合
0.7% Argrose
上胶和
20%FBS+2
×
1640+
2
×
PS
，每种细胞需
先配
2ml
（
20%FBS+
2
×
1640+2
×
< br>PS
）
+2ml0.7%
Ar
grose
上胶于离心管中混匀，放入
42
℃水浴锅中保持。
再将细胞悬液加入上述混合液中，
混匀后
迅速加入
6
孔盘中，
每
孔
1ml
。待上层琼脂凝固后，置于
< br>5%CO
2
，
37
℃，培养
2
－
3
周。
8
、<
/p>
间隔
2
天补加
2
00ul 10%FBS+1640+1
×
PS
，以防过于干燥。
9
、计数
克隆：
把平皿放置在倒置显微镜下（
100
×），在镜下随机选择
10
个视野，计数
< br>视野中大于
50
个克隆数
(
﹥
0.05mm
的克隆
)
和所有克隆数，克隆形成率
=
大
于
50
个克
隆数
所有克隆数
×
100%
。每孔加入
1ml
的
0.0
05%
结晶紫染色
1h
以上，镜下拍照
。